革兰氏染色：原理，材料，技术和用途 - 生物学 - 2025

在革兰氏染色是最简单，最实用的染色在诊断微生物学技术。这项技术是由丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·格兰（Hans Christian Gram）于1884年发明的，他根据细胞壁的组成将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性。

Hucker在1921年对该技术进行了某些修改，以稳定试剂并提高染色质量，这就是为什么Gram染色剂也被称为Gram-Hucker的原因。

各种涂片均沾有革兰氏染色。A.革兰氏阳性球菌。B.革兰氏负极棒。C.革兰氏阳性，多形核和单核杆菌。D.酵母。

利用这种技术，还可以观察微生物的形状，即，如果它们是球菌，细菌，球菌，多形，丝状等。以及它在空间中的分布：成簇，成链，孤立，成对，成四股等。

当怀疑有细菌感染时，应将收到的大多数样品涂在载玻片上，并对革兰氏染色进行显微镜检查。

在获得最终培养结果之前，革兰氏报告将指导医生确定哪种微生物可能是感染的原因。

在某些情况下，患者的生命会受到很大影响，因此，医生在等待鉴定微生物的同时，急切需要革兰氏报告进行经验性治疗。

例如，如果革兰氏杆菌显示脑脊液中存在革兰氏阳性球菌，那么医生将根据为此制定的方案指导使用消除此类细菌的抗生素进行初始治疗。

一旦最终结果与分离出的微生物的名称及其各自的抗菌素有关，医生将评估是否更改治疗方法。该决定将根据对微生物对他正在接受的抗生素的敏感性以及患者的病情发展的研究做出。

基础

这是一项具有四个基本步骤的技术：染色，媒染剂固定，变色和复染。因此，除了为细菌着色之外，该技术还使它们得以分化。

结晶紫是使用的第一种着色剂。它对肽聚糖具有亲和力，并将所有存在的细菌染成紫色，随后放置lugol，起到媒染剂的作用，也就是说，它将诱导形成不溶性结晶紫-碘复合物-细胞内核糖核蛋白。 。

具有肽聚糖壁厚的革兰氏阳性细菌形成更多的复合物（结晶紫碘），因此它们保留了染料。

另外，它还影响革兰氏阳性细菌的壁含有大量的不饱和酸，这些不饱和酸对氧化剂（Lugol）表现出极大的亲和力。

同时，革兰氏阴性细菌具有一薄层肽聚糖，这使细菌形成的复合物少于革兰氏阳性细菌。

然后是变色步骤，革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的行为有所不同。

革兰氏阴性细菌的外膜富含脂多糖，是其细胞壁的一部分。脂肪通过与丙酮醇接触而被破坏，因此外膜变得不稳定，释放出紫色晶体。

然后用番红花或碱性品红抵制，然后变红。

对于革兰氏阳性细菌，它们可以抵抗褪色，因为漂白剂通过闭合毛孔来起作用，从而防止结晶紫/碘复合物泄漏出去。

因此，结晶紫的着色保持稳定，并且没有藏红花红或品红的空间。这就是为什么这些细菌会染成深蓝色或紫色。

材料

革兰氏染色组包括：

• 紫罗兰色玻璃
• 卢戈尔
• 丙酮醇
• 番红花或碱性品红

染料和试剂的制备

结晶紫溶液

解决方案：

紫水晶------------- 2克

乙醇95％----------- 20cc

解决方案B：

草酸铵----------- 0.8克

蒸馏水------------- 80 cc

为了最终制备结晶紫，必须将溶液A用蒸馏水以1:10稀释，并与4份溶液B混合。使用前将混合物保存24小时。使用滤纸过滤入琥珀色的染色瓶中。

每天使用的量转移到琥珀色的滴管瓶中。

碘-卢戈

称量并测量每种化合物的指示量，如下所示：

碘晶体------------- 1gr

碘化钾------------- 2gr

蒸馏水------------- 300 cc

碘化钾一点一点地溶解在水中，然后加入碘。将该溶液剃成琥珀色瓶。

每天使用的量转移到带有滴管的较小的琥珀色瓶中。

漂

95％乙醇-----------– 50毫升

丙酮------------------ 50毫升

它是等份准备的。盖好，因为它易于蒸发。

放在滴管瓶中。

此制剂可在5-10秒的中等时间内变色，因此最推荐使用。

初学者更喜欢仅使用95％的乙醇，其褪色速度低于10到30秒。

虽然经验丰富的人可以使用纯丙酮，但在1到5秒内会很快发生变色。

对比

番红花原液

番红花-------------– 2.5克

乙醇95％--------– 100 cc

称量指定量的番红花后，将其溶于100 ml的95％乙醇中。

从储备溶液中制备有效的番红花溶液。

为此，测量10 cc的储备溶液，加入90 cc的蒸馏水制成100 ml。

建议将每天使用的量转移到带有滴管的琥珀色瓶中。

使用Kopeloff改良的Gram-Hucker染色剂可以更好地将革兰氏阴性染色的微生物（如某些厌氧菌，军团菌，弯曲杆菌和布鲁氏菌）染色，从而使革兰氏阴性菌的染色效果更好，称为克-科佩洛夫染色

此技术将番红花染料变为碱性品红。通过这种修改，可以有效地使上述微生物着色。

试剂储存

配制好的着色剂应在室温下保存。

准备要着色样品的涂片

样本中必须至少包含10 ^5种微生物，然后才能观察涂片中的微生物。可以从直接样品或固体或液体培养基中的培养物中制成涂片。

涂片应均匀，分布均匀且不要太厚，以更好地显示存在的结构。

-直接样本克

未离心的克

混合尿液并将10 µl放在载玻片上。观察到至少一个细菌/浸液区域表明存在感染。

这意味着在85％的情况下，培养物中的尿液大约超过100,000 CFU / ml（10 ⁵ CFU / mL）。

此方法对低于100,000 CFU的菌落计数无用。

脑脊液克

应将CSF离心，除去上清液，然后将沉淀物铺在载玻片上。在正常条件下，该液体是无菌的。观察细菌表明感染。

呼吸样本克

痰，支气管或支气管肺泡灌洗液革兰氏菌虽然可能存在多种微生物，但除了可用于观察的细胞类型外，还将始终指导诊断。

如果是痰液，应使用样本中最化脓的部分进行涂片检查。

粪便克

不建议对这种类型的样品进行革兰氏分析，因为它没有诊断价值。

-农作物

它们可以通过两种方法完成，一种方法是液体培养，另一种是固体培养。

液体培养

从液体培养来看，这非常简单。将几份浑浊的肉汤放在燃烧器下方，放在干净干燥的载玻片上，使其从中心向外围圆周运动，以使物料均匀分布。

让它在空气中自然干燥。干燥后，将材料加热固定在板上。为此，在镊子的帮助下，将薄板穿过本生灯的火焰3至4次，注意不要燃烧该材料。

将该薄片冷却并放置在着色桥上。

庄稼

要对固体培养物进行革兰氏染色涂片，请按照下列步骤操作：

在选择要采集的菌落之前，应准备载玻片，并放置约两滴无菌生理盐水溶液。

如果原始培养板包含几种不同类型的菌落，则将选择每种菌落的单独菌落进行革兰氏染色。每个菌落都将带有铂环，以溶解在先前放置在玻片上的盐溶液中。

从中心向外围进行圆周运动，以将菌落均匀地分布在玻片上。

让它在空气中自然干燥。干燥后，将纸张加热固定，如前所述（通过用打火机燃烧幻灯片），注意不要燃烧该材料。

必须对每种不同类型的菌落执行此过程。在一张纸上，应注意观察到的顺序，例如：

菌落1：β-溶血性黄色菌落：在簇中观察到革兰氏阳性球菌

菌落2：乳白色菌落，无溶血：观察到革兰氏阴性球菌。

每张幻灯片都必须贴上标签，以了解我们正在观察的内容。

技术

革兰氏染色技术非常容易执行并且相对便宜，并且在微生物实验室中不能错过。

可以这样完成：

1. 加热修复涂片并放置在染色桥上。
2. 用水晶紫完全覆盖幻灯片1分钟。
3. 用水冲洗 不要干
4. 用lugol溶液覆盖床单，静置1分钟。用水冲洗 不要干燥。
5. 在酒精丙酮中轻轻摇晃漂白5-10秒。或者，将纸张垂直放置，然后将脱色剂滴在其表面上，直到去除多余的未保留的紫罗兰色玻璃为止。不要超过。
6. 用水冲洗 不要干燥。
7. 更换染色桥上的载玻片，并用番红素（Gram-Hucker）覆盖30秒钟，或用碱性品红（Gram-Kopeloff）覆盖1分钟。
8. 用水冲洗
9. 让其在直立位置自然风干。

干燥后，将1滴浸入油中，在光学显微镜的100X物镜下观察。

效用

该技术可以区分大多数细菌的形态学差异。

酵母也以这种颜色来区分。他们将水晶变成紫罗兰色，也就是说，它们使革兰氏染色呈阳性。

另一方面，可以区分形成孢子的革兰氏阳性棒，其中在芽孢杆菌内观察到形成孢子的清晰空间，尽管孢子不能很好地染色。其他技术（例如Shaeffer-Fulton）也用于染色孢子。

应当注意的是，这种染色不能用于对所有类型的细菌进行染色，也就是说，在某些情况下，这种染色不起作用。

在这种情况下，可以提到缺少细胞壁的细菌。例如：支原体属，原生质球，脲原体，L型和原生质体。

它还会用富含分枝杆菌酸的壁（例如分枝杆菌）和细胞内细菌（如衣原体和立克次体）对非常差的细菌染色。

对大多数螺旋藻细菌染色也无效。

在同一样品中可以观察到相同属的细菌，如革兰氏阳性和革兰氏阴性。发生这种情况时，称为可变革兰氏染色，这可能是由于养分，温度，pH或电解质浓度的变化所致。

常见错误

夸张的漂白

变色步骤中的夸张可能导致观察到假革兰氏阴性微生物。

没有等待足够长的干燥时间来添加浸油

它可以使革兰氏阳性细菌将革兰氏阴性染色（假革兰氏阴性）。发生这种情况的原因是，在古老的文化中，细菌很可能会死亡或变质，并且在这些条件下细菌不会保留结晶紫。

使用非常旧的lugol解决方案：

随着时间的流逝，lugol失去其特性，并且颜色褪色。如果使用已经退化的试剂，它将无法很好地固定紫色结晶，因此有可能获得错误的革兰氏阴性微生物的图像。

蓝色背景

正确变色的背景将为红色。蓝色背景表明变色不足。

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