的DNA测序（脱氧核糖核酸）是分子生物学实验室的过程，它允许对知道核苷酸在感兴趣的遗传物质的顺序。此外，还可以公开RNA（核糖核酸）的测序。
这种技术对于生物科学的发展是必不可少的。它也适用于其他知识领域，例如医学诊断和法医调查。
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以前，DNA链的测序被认为是缓慢而昂贵的活动，仅允许鉴定寡核苷酸中的几个碱基对。
如今，随着科学的所有进步，由于在该领域进行了近50年的研究，DNA测序已成为全球许多实验室的常规操作。就链长而言，可以在很短的时间内对多达数百万个碱基对进行测序。
为此，开发了数十种价格和精度各不相同的技术。在本文中，我们将描述古典技术和现代技术，每种技术都有其优缺点。
迄今为止，测序技术允许获得从小原核生物和酵母菌到人类基因组的完整基因组序列。
DNA结构
为了了解用于DNA测序的方法和技术，有必要了解分子结构和组成的某些关键方面。
DNA是在所有生物中发现的生物分子，从细菌到大型水生动物。细胞器-像线粒体和叶绿体-内有一个环状DNA分子。即使在某些病毒中，发现的遗传物质也是DNA。
从结构上讲，DNA是核苷酸的集合。每个由碳水化合物，含氮碱（A，T，C或G）和磷酸基团组成。DNA测序的目的是揭示在序列中发现四个含氮碱基的顺序。
历史
1950年代中期，研究人员沃森（Watson）和克里克（Crick）使用指纹图谱技术描述了DNA的结构。但是，这些研究人员都没有找到解开序列的方法。
尽管有某些前辈，但最重要的事件是1977年创立了Sanger方法。该方法的父亲Frederick Sanger是英国的生物化学家，因对生物科学的巨大贡献而获得了两次诺贝尔奖。
该技术在文献中也称为“链终止”或双脱氧核苷酸。下面将描述该技术的原理以及基于其改进和创新而开发的原理。
桑格法
Sanger方法的发展代表了分子生物学中的关键事件。它涉及通常在细胞中发生的DNA复制过程的基本组成部分，但增加了一个特殊的组成部分：双脱氧核苷酸。
反应的主要成分
-DNA聚合酶：DNA聚合酶是该过程的关键要素。该分子参与DNA链的复制，其作用是合成新链，将三磷酸脱氧核糖核苷酸与互补链配对。
回想一下，在DNA中，胸腺嘧啶（T）通过两个氢键与腺嘌呤（A）配对，而胞嘧啶（C）通过三个键与鸟嘌呤（G）配对。
-核苷酸：Sanger测序涉及两种类型的核苷酸，四个2'-脱氧核苷酸（缩写为dATP，dGTP，dCTP和dTTP）和四个特殊的双脱氧核苷酸（ddATP，ddGTP，ddCTP和ddTTP）。
尽管双脱氧核苷酸与通常掺入DNA的单体相似，但它们的结构中没有-OH基团。这使得不可能在链上添加新的核苷酸。
因此，当以完全随机的方式向形成的链中添加特殊核苷酸时，合成就会瘫痪。因此，在反应结束时，存在不同大小的链，每个链的反应在不同点处停止。
实验上，准备了四个测试。每个都包含从感兴趣的生物样品中提取的DNA，正常核苷酸和四种特殊核苷酸类型之一。或者特殊核苷酸用某种类型的荧光标记物标记（请参见下面的自动测序）。
读取结果
第一步是根据合成链的大小将其分离。有些会比其他更长，具体取决于特殊基地的所在地。
存在不同的生化技术，这些技术允许使用大小作为区分属性来分离混合物的成分。在桑格方法中，不同的链通过电泳分开。在该技术的更复杂的变体中，使用了毛细管电泳。
因此，较长的股比较短的变体行进少。然后，该系统通过读取器，该读取器识别每个双脱氧核苷酸中包含的标记。这样，可以知道序列的顺序。
这种“第一代”技术能够读取不超过1千碱基的DNA片段。目前，Sanger方法已在各种实验室中使用，通常以其现代变体形式使用。另外，它可用于证实使用最复杂的技术获得的结果-但精度较低。
自动排序
当需要大规模排序时，可通过自动化来加速该过程。这是Sanger链终止方法的一种变体，其中的引物用荧光产物标记以区分它们。
随后，将反应产物电泳进行电泳-全部在一个泳道上进行。当每个片段离开凝胶的最后部分时，可通过其荧光标记快速识别出该片段，误差约为1％。
最复杂的系统具有多达96个毛细管的系统，该系统由与机器人连接的计算机管理。也就是说，可以同时测试96个DNA样品。因此，涉及电泳和结果分析的过程是完全自动化的。
在一天之内，这些系统最多可以测序550,000个碱基。在此过程中，不需要人工，仅需15分钟即可启动该方法。
Maxam-Gilbert测序
在桑格发表他的作品的同时，两位名叫艾伦·麦克斯坦（Allan Maxan）和沃尔特·吉尔伯特（Walter Gilbert）的研究人员成功地开发了另一种获取DNA序列的方法。该方法在当时很受欢迎，但后来由于Sanger方法的改进而被取代。
与Sanger方法相反，Maxan和Gilbert测序（或众所周知的化学测序）不涉及杂交反应。该方法包括在一端用反应剂标记，然后进行纯化过程。
该技术的不利方面之一在于其巨大的复杂性以及对使用者而言危险的化学药品的使用。通过将DMS，甲酸，肼和肼与盐一起使用可诱发化学破坏。
处理
该方案开始于在链的5'末端用磷标记物32进行标记，然后发生氮碱基的化学修饰并将其分离。最后，发生无碱基区域的切割。
首先，将要排序的字符串缩短成较小的段。用限制酶进行该步骤，其导致末端突出。
接下来，用碱性磷酸酶进行反应，其目的是消除磷酸基团。因此，多核苷酸激酶可用于进行标记。
链被变性（两条链打开）。然后使用化学药品。这些裂解反应以受控的方式进行，并且已知每种施加的化学断裂是什么类型的键。
读取结果
与桑格（Sanger）方法一样，读取结果涉及通过电泳系统中获得的链大小进行分离。由聚丙烯酰胺组成的系统可为读取凝胶获得非常合适的分辨率。
大规模测序
大规模测序包括英文“ Next Generation Sequencing”中的一系列新颖方法，缩写为NGS。
分类为NGS的方法需要进行先前的DNA扩增步骤（它们不适用于单个分子）。此外，所使用的平台差异很大。最受欢迎的方法的原理如下：
焦磷酸测序
它涉及监测焦磷酸的释放，焦磷酸的释放是在每次将新核苷酸添加到DNA链时发生的。酶系统是耦合的，因此每次引入新的核苷酸时都会发生光的发射（可由照相机检测）。
该过程从每个氮碱基的单独孵育开始，以验证是否存在发光。焦磷酸测序可以读取长链，但发现的错误率很高。
综合测序
这涉及掺入标记的核苷酸。添加，洗涤这些荧光组分，并记录所掺入的核苷酸。然后，去除核苷酸标记，并且链的合成可以继续。在下一步中，还将掺入标记的核苷酸，并将重复上述步骤。
当荧光标记没有被完全去除时，该技术的缺点就出现了。这些排放会产生背景误差，从而导致严重误差。
连接测序
该技术不同于其他技术，因为它不使用DNA聚合酶。相反，该方法的关键酶是连接酶。在这里，使用了荧光标记的DNA片段，它被酶连接并被检测到。
这种技术的最大问题是它能够处理的片段长度短。
离子激流测序
该技术基于每次引入新核苷酸时释放的H +离子的测量。该原理与焦磷酸测序非常相似，但价格便宜得多。
例子
人类基因组测序
对人类基因组进行测序一直是生物学中最有希望的挑战之一，也是科学史上最受赞誉的竞争之一。实际上，对于参与该项目的科学家而言，基因组测序已成为一项竞争。
1990年，他发起了由著名科学家诺贝尔奖获得者詹姆斯·沃森（James Watson）领导的所谓的“人类基因组计划”。一年后的1991年，Venter挑战了“击败”沃森并对其进行基因组测序。然而，在1992年，沃森退休，该命令由另一位研究人员接管。
1995年，Venter宣布他在通过随机测序方法完成细菌基因组完整测序方面的成功。同样，反对派团队一年后宣布了酵母基因组的测序。
该学位于2000年终止。两家公司都在科学界最负盛名的两本期刊《自然》和《科学》上发表了他们的初步全基因组结果。
但是，科学家们继续致力于改进建议，并在2006年完成了某些人类染色体的序列。
重要性和应用
知道诸如DNA之类的重要分子的核苷酸顺序对于生物学家和相关专业人士而言很有价值。该多核苷酸链包含开发和维持所有生命形式所需的所有信息。
由于这些原因，对该序列的了解对于生物学研究至关重要。从根本上说，测序使测量生物系统最重要的特性之一并确定它们之间的差异成为可能。
测序被分类学家和系统学家广泛使用，因为某些DNA序列除了可以提出关于它们之间的系统发育关系的假设之外，还可以建立确定两个生物是否属于同一物种的标准。
另外，DNA测序在医学和诊断学中也有应用。例如，存在廉价且可访问的系统，该系统通过测序可以使用所谓的单核苷酸多态性（SNP）评估发展某些疾病（如癌症）的趋势。
犯罪和法医类型的调查也已经被测序技术所丰富，可以用作某些人参与犯罪的可靠证据。
参考文献
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