氧化酶测试：基本原理，程序和用途 - 生物学 - 2025

所述氧化酶试验是一种诊断方法，该方法示出了所述酶复合物称为细胞色素氧化酶C的存在。该系统诱使细胞色素转化为氧化态，因为它捕获了氧气，而氧气又充当了呼吸链中的最后一个电子受体（H ⁺）。

术语氧化酶是指酶细胞色素氧化酶（也称为吲哚酚氧化酶）的简写方式。在远古时代，人们认为细胞色素氧化酶和吲哚酚氧化酶是两种不同的酶，但是今天人们知道它们是相同的。

阳性和阴性氧化酶测试。资料来源：未提供机器可读的作者。假定为Alpha.prim〜commonswiki（基于版权主张）。

就其本身而言，细胞色素是含有铁并完成细胞色素氧化酶系统的血红蛋白。细胞色素可能因物种而异。

细胞色素有不同的品种（细胞色素a1，a2，a3和0）。有些细菌一次只能产生一种细菌，而其他细菌一次最多只能产生两三种。从这个意义上讲，细胞色素a和a3的存在被称为细胞色素氧化酶c。这是氧化酶测试检测到的细胞色素的类型。

奈瑟氏球菌和假单胞菌属均含有细胞色素氧化酶c。这些属给出了阳性氧化酶测试，有助于将它们分别与不动杆菌属和嗜单胞菌属区分开。

还有其他属氧化酶阳性的属。

基础

细胞色素氧化酶c系统的特征

细胞色素氧化酶c系统的工作方式如下：氧化酶阳性的微生物利用氧气通过有氧呼吸产生能量。该系统的工作归功于电子从供体物质（例如NADH ^+）到受体物质（在这种情况下为氧气）的传输。

根据微生物拥有的细胞色素氧化酶系统，这会产生能量（ATP）和水或过氧化氢。

这就是为什么大多数氧化酶阳性细菌也是过氧化氢酶阳性的原因，这是消除产生的过氧化氢的必要条件，因为该物质对细菌有毒。

细胞色素氧化酶c系统存在于一些好氧细菌，一些兼性厌氧菌中，微需氧菌很少，并且没有严格的厌氧菌。后者是可以理解的，因为严格的厌氧菌不能在氧气存在下生活，因此它们缺乏细胞色素氧化酶系统。

测试原理

在该测试中，它使用了充当人工电子受体的物质，取代了电子传输链中的天然电子受体。

主要使用染料，例如对苯二胺和吲哚酚，它们充当受体底物和人造电子供体。

对苯二胺被细胞色素氧化酶c系统氧化。还原形式的染料是无色的，但其氧化形式的染料是有色的。

这就是证明细胞色素氧化酶c系统存在的方式。因为阳性反应会产生淡紫色或蓝紫色，这取决于所使用的试剂。

另一方面，如果呼吸链中的最后一个电子接受物质与氧气不同，则氧化酶测试将为阴性（不产生任何颜色）；厌氧微生物就是这种情况。

同样，如果微生物使用的细胞色素与细胞色素氧化酶c不同，它也会给出阴性结果。

处理

有多种用于氧化酶测试的试剂和方案，均用于同一目的。

试剂种类

Kovacs试剂，Gordon和McLeod试剂，Nadi试剂，Carpenter，Suhrland和Morrison试剂，以及氧化酶圆片的使用。

-Kovacs氧化酶试剂

它由1％的四甲基对苯二胺盐酸盐组成。

通过将1 g的上述物质溶解在50 ml的蒸馏水中来制备Kovacs试剂。对其进行加热直到完全溶解。转移至容量足够的琥珀色瓶中，并用蒸馏水补足至100 ml。使用前至少等待15分钟。存放在避光的冰箱中。

它被标记为Kovacs氧化酶试剂，以区别于用于显示吲哚试验的Kovacs试剂。该试剂是最敏感的，毒性较小，但比其余试剂贵。

用该试剂可证明有阳性反应，菌落颜色变为淡紫色，淡紫色迅速变为几乎黑色。阴性反应是明显的，因为菌落没有颜色变化，或者呈淡粉红色。培养基也会变黑，但这并不意味着阳性反应。

使用这种试剂，反应时间至关重要，在5到15秒之间发生的颜色变化被认为是阳性反应。

-Gordon和McLeod试剂

它由二甲基对苯二胺二盐酸盐（也称为N-二甲基对苯二胺或对氨基二甲基苯胺一盐酸盐）组成。如Kovacs氧化酶试剂所述制备，用所涉及的物质代替。

尽管所有含对苯二胺的试剂都不稳定，但该试剂比Kovacs氧化酶试剂更稳定。

此反应稍后，可以解释为阳性，在10至30分钟内出现蓝紫色。

-纳迪试剂

它由1％的乙醇中的α-萘酚（95％的乙醇）和1％的氨基二甲基苯胺组成。将混合物等分制备，并使用无水乙醇作为稀释剂，直至补足至100 ml。

-木匠，苏尔兰德和莫里森试剂

它由1％对氨基二甲基丙氨酸草酸酯组成。按照与Kovacs氧化酶试剂相同的方法进行准备，但要更改相应的物质。

准备好溶液后，按以下步骤准备试纸：6-8 cm Whatman No. 1滤纸试纸条浸有1％二甲基对苯二胺草酸酯试剂。

允许它们干燥而不接触金属，存放在带有干燥剂的螺口罐中，然后存放在冰箱中。这些胶条可稳定长达6个月。

它是上述所有试剂中最稳定的试剂，在溶液中可持续使用长达6个月。另一个优点是，如果直接在平板上使用，则不会使菌落周围的培养基着色。

红色的外观被解释为阳性测试。

-氧化酶光盘

它们是商业光盘，其中装有用于氧化酶测试的试剂。市场上有几个商业品牌。

它的使用非常实用，因为不必准备新鲜的试剂，从而简化了工作。只要正确保存光盘，所获得的结果就是可靠的。

通讯协定

直接印版法，纸上间接法和使用浸渍有氧化酶试剂的圆盘。

-直接板法

为此目的，将2或3滴任何上述试剂直接添加到不含葡萄糖的培养基平板中所含的菌落上。

解释菌落颜色的改变或不改变，而不是培养基的改变。有效的反应时间取决于所用试剂。

-纸上间接方法

将一块滤纸（Whatman No. 1）切成6 cm ²的大小，并将其放入空的培养皿中。

在纸上加入2或3滴Kovacs氧化酶试剂，用铂金柄或木牙签吸取待研究的菌落的一部分，并在试剂浸渍纸上直线分布。在5到10秒内解释。

用Carpenter，Suhrland和Morrison试剂制备试纸条后，将菌落散布在干燥试纸条上。单个试纸用于测试多个菌株。在10秒内解释。

-磁盘（米

用无菌蒸馏水湿润商品光盘，并叠加在要研究的菌落上。建议使用温度为35°C的平板，如果使用室温平板或冷藏平板，反应会稍微慢一些。解释10到20秒之间的颜色变化。

可以使用血液或巧克力琼脂上的菌落。

-磁盘（间接方法）

如前所述阻尼光盘。将其放在空的培养皿中。取足够数量的菌落，用铂金手柄或木牙签研究并放在磁盘上。解释10到20秒之间的颜色变化。

用

奈瑟氏菌属和不动杆菌属有时在形态上非常相似，因为即使不动杆菌属是革兰氏阴性杆，它有时也可以呈球体形式并成对分布，模拟奈瑟氏菌属。

在这种情况下，氧化酶测试确实有用。奈瑟氏球菌属阳性，不动杆菌属阴性。

然而，莫拉氏菌属与奈瑟氏菌属非常相似，两者均产生阳性反应。这就是为什么必须始终进行碳水化合物发酵测试以进行最终鉴定的原因。

另一方面，氧化酶测试可用于区分属于肠杆菌科的细菌（所有氧化酶均为阴性）与其他发酵罐，如巴斯德氏菌，气单胞菌，油菜单胞菌属（氧化酶阳性）。

弧菌属和幽门螺杆菌属均为氧化酶阳性。

质量检查

使用已知的大肠杆菌菌株作为阴性对照，并使用铜绿假单胞菌菌株作为阳性对照。

局限性

-试剂必须使用新鲜配制的试剂，由于它们非常不稳定，因此在室温下在溶液中的保存期限很短。冷藏后可以持续5天到2周。

-试剂是无色的，如果它们改变颜色，则必须将其丢弃。损坏的光盘会显示出来，因为它们会随着时间的流逝变暗。

-在15至60秒之间与Kovacs氧化酶试剂的阳性反应被认为是延迟反应，在60秒后应被视为阴性。

-如果使用任何带有二甲基-对苯二胺的试剂，流感嗜血杆菌会产生负的氧化酶反应，但是如果使用Kovacs氧化酶试剂（四甲基-对苯二胺），则会产生阳性反应。

-含葡萄糖的培养基会干扰测试，产生假阴性。

-百日咳博德特氏菌菌株来自高度浓缩的血琼脂平板会产生假阳性反应。

-使用金属（铁）手柄会产生假阳性反应。

建议

-由于试剂非常不稳定并易于自氧化，因此建议将等份的1至2 ml冷冻并根据需要除去。

-延迟试剂自动氧化的另一种方法是在制备试剂时添加0.1％的抗坏血酸。

-由于试剂不稳定，建议每周进行质量控制。

-请勿使用未通过质量控制测试的试剂。

参考文献

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