过氧化氢酶测试：原理，技术和用途 - 生物学 - 2025

所述过氧化氢酶试验是在实验室细菌学用于揭示在那些拥有它的细菌酶过氧化氢酶的存在的方法。与革兰氏染色剂一起，它们是应该对新分离出的微生物进行的主要测试。这些测试指导微生物学家确定微生物的最终识别步骤。

通常，含有细胞色素的细菌具有过氧化氢酶，这意味着兼性需氧和厌氧细菌应具有该酶。但是，也有例外，例如链球菌，尽管它是兼性厌氧微生物，但不具有过氧化氢酶。

运行过氧化氢酶测试，显示阳性反应。资料来源：未提供机器可读的作者。假定为Nase（基于版权主张）。

这就是为什么过氧化氢酶测试主要用于区分葡萄球菌科和微球菌科（均为过氧化氢酶阳性）和链球菌科（过氧化氢酶阴性）的原因。

同样，芽孢杆菌属（过氧化氢酶阳性）与梭状芽胞杆菌属（过氧化氢酶阴性）等等。

基础

过氧化氢酶是一种被分类为氢过氧化物酶的酶，这意味着它们使用过氧化氢（H ₂ O ₂）作为底物。

它也被认为是一种氧化还原酶，因为在它参与的反应中，有一种元素充当电子给体（还原性物质），另一种充当电子受体（氧化性物质）。

过氧化氢酶是一种包含带有四个三价铁原子的脯氨酸基团的蛋白质（Fe ⁺⁺⁺），因此它是一种同蛋白。铁离子在反应过程中保持氧化状态。

可以说过氧化氢酶是一种解毒酶，因为它的功能是消除细菌代谢过程中产生的对细菌有毒的物质。这些物质中有过氧化氢。

过氧化氢是由糖的需氧分解形成的。此过程发生如下：

超氧离子（O ₂ ^-）（自由基）形成为通过有氧途径葡萄糖同化的最终产物。这是有毒的，并被超氧化物歧化酶消除，该酶将其转化为气态氧和过氧化氢。

过氧化氢对细菌也有毒，必须除去。过氧化氢酶将过氧化氢分解成水和氧气。

过氧化氢酶可以作用于除过氧化氢以外的底物，例如醇，醛，酸，芳族胺和酚。但是，过氧化氢也可以被过氧化氢酶用来氧化其他有毒化合物，例如甲醇和乙醇。

同样，过氧化氢酶也存在于吞噬细胞中，从而保护其免受过氧化氢的毒性作用。

过氧化氢酶测试的常规技术

-滑动方式

材料

3％过氧化氢（10体积）。

显微镜载玻片

一次性塑料手柄或木制牙签。

处理

取足够多的菌落进行研究，而不要触碰其来源的琼脂。菌落必须是新鲜的，也就是说，必须培养18至24小时。

将菌落放在干燥的玻片上，并向其中加入3％的过氧化氢（也可以使用30％H ₂ O ₂）。立即观察是否释放了气泡。

解释

积极反应：放出气体，通过形成气泡（强烈起泡）来证明。

不良反应：无气泡形成。

-纯文化中的直接方法

将1 ml的3％H ₂ O ₂放在不含血液（最好是营养琼脂）的纯板或楔形培养物中。立即观察是否有气泡形成。也可以使用30％的H ₂ O ₂。

它的解释与porta对象方法相同。

-使用毛细管或Fung和Petrishko的方法

通过毛细作用，用3％的过氧化氢填充67 mm的毛细管至20 mm的高度。

用填充有3％H ₂ O ₂的毛细管接触要研究的分离菌落_。大约在10秒钟内观察毛细管是否充满气泡。这种方法可以对杂交中的反应进行半定量：

没有交叉，就没有气泡（负反应）。

+ ----气泡少（反应弱或反应迟缓）。

++ ---大量气泡（中度反应）。

+++-气泡到达另一端（强烈反应）。

-Taylor和Achanzar方法进行过氧化氢酶测试，结果令人怀疑

将孤立的菌落放在干净，干燥的玻片上，然后滴入0.5％H ₂ O ₂并盖上盖玻片。观察是否有残留气泡形成。

解释：气泡的存在表明反应是肯定的。没有气泡，它被解释为负面反应。

分枝杆菌物种的过氧化氢酶测试

此技术需要通过控制pH和温度来完成。由于操作不同的分枝杆菌属细菌是危险的，因此必须在层流罩下进行。

-材料

过氧化氢30％或110体积（超草）。

磷酸盐缓冲液pH 7

10％吐温80

分枝杆菌楔形培养3-4周

-制备

磷酸盐缓冲液pH 7

衡量：

1.361g 无水磷酸一钾（KH ₂ PO ₄）。

1.420克无水磷酸二钠（Na2HPO3）。

将两种盐溶解在少量无菌蒸馏水中，并用水补足至1000 ml。

10％吐温80

对Tween 80进行1:10的稀释，以商业方式进行浓缩，操作步骤如下：

取1毫升Tween 80，将其放入少量蒸馏水中，溶解，然后用水补足至10毫升。

最终试剂

将一定量的磷酸盐缓冲液与10％的吐温80（等份）混合。在实验室中定义您要准备多少。

-处理

将5 ml磷酸盐缓冲液放入无菌的旋盖试管（电木）中。

用接种环，取足够多的分枝杆菌接种在楔形物中的菌落，并溶解在磷酸盐缓冲液中。

盖好管子，不要过度拧紧螺纹。放在68°C的水浴中20到30分钟。取出并冷却至22-25°C

量取0.5毫升最终试剂（混合物），并将其与冷溶液一起加入试管中。观察是否形成气泡。

它的解释与以前的技术相同。

用

当在富集培养基中获得菌落生长时，应对获得的菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶测试。这将指导微生物学家进行最终鉴定所遵循的程序。

资料来源：作者MSc编写。玛莉莎·吉尔（Marielsa gil）

质量检查

要评估过氧化氢试剂的良好性能，请使用新鲜培养的对照菌株，例如金黄色葡萄球菌作为阳性对照，而链球菌sp菌株作为阴性对照。

用作阳性对照的另一种方法是在血琼脂上滴一滴过氧化氢，因为红细胞具有过氧化氢酶，因此，如果试剂处于良好状态，将会起泡。

巧克力琼脂可以用作阴性对照，这里的红细胞已经被溶解，检测结果为阴性。

局限性

-请勿使用旧文化进行测试，因为这会导致假阴性。

-如果小心不要接触琼脂，请避免从血琼脂上的培养物中获取菌落；该过程可能导致假阳性，因为红细胞中含有过氧化氢酶。

-如果您用白金手柄拿住菌落，请不要颠倒程序的顺序，因为这会产生假阳性。这是因为铂能够与过氧化氢反应而起泡。

-如果过氧化氢试剂很旧，请勿使用，因为该试剂非常不稳定，并且随着时间的流逝会分解。

-保持双氧水试剂避光并冷藏，以防止损坏。

-每次使用过氧化氢试剂时都要进行质量控制。

-考虑到如果使用30％的H ₂ O ₂，则该反应比用3％的H ₂ O ₂进行的反应更强。

参考文献

1. Koneman E，Allen S，Janda W，Schreckenberger P，Winn W.（2004年）。微生物学诊断。第五版。社论Panamericana SA阿根廷。
2. 福布斯（Forbes B），萨姆（Sahm D），韦斯菲尔德（Weissfeld）A.（2009）。Bailey&Scott微生物学诊断。12版。社论Panamericana SA阿根廷。
3. Mac Faddin J.（2003）。生化测试用于鉴定具有临床重要性的细菌。第三版。社论泛美。布宜诺斯艾利斯。阿根廷。
4. BD实验室。过氧化氢酶-Gotario试剂。可在以下网址获得：http：//winklerltda.cl
5. Vadequímica实验室。过氧化物。数量和百分比之间的等效性。可在以下网址获得：vadequimica.com