所述免疫是一种强大的技术使用共价键合的荧光分子以识别固定到固体载体上的细胞样品中特定靶的抗体的免疫染色。
这项技术涉及具有免疫学特异性的显微镜观察，因此可以观察可以呈递少量抗原的活细胞或死细胞。它广泛用于研究领域和各种病理学的临床诊断中。
心肌细胞中肌动蛋白丝的免疫标记（来源：Ps1415，来自Wikimedia Commons）
该技术主要是定性的（具有一些定量变体），必须专门通过荧光团的产物信号来可视化样品，荧光团是与抗体结合的荧光分子，能够在特定波长激发。
在细胞内，研究蛋白质的存在/不存在和亚细胞位置非常有用。该技术最初在临床环境中用于诊断病毒（例如流感），随后用于许多其他传染病。
这是一种高度敏感的技术，并且使用适当的显微镜设备，它可以具有很好的分辨率。为了观察，需要使用共聚焦或落射荧光显微镜。
然而，尽管它非常流行，但在获得产生背景“噪声”的非特异性荧光方面可能会出现一些重要的问题，这常常限制了结果的正确读取。
基础
免疫荧光是基于对抗体和抗原之间相互作用反应的生物学现象的利用。它必须通过将荧光分子激发到特定波长来具体化该反应的可视化或检测。
抗体是从活动性B细胞分泌的免疫球蛋白蛋白，是针对抗原特异性产生的，可以高亲和力和特异性结合。免疫荧光利用可溶于血清的IgG免疫球蛋白。
抗体是由两个短（轻）和两个长“ Y”形（重）肽链组成的，最大950 kDa的分子。轻链和重链都分为两个域：一个可变区，能够识别抗原，另一个恒定区或保守区，每个物种都有其特征。
抗原在功能上被定义为可以被抗体识别的分子，并且在大多数情况下是蛋白质。当动物暴露于抗原时，免疫系统的淋巴细胞被激活，产生针对该抗原的特异性抗体，并起防御系统的作用。
抗原，例如蛋白质，例如可以具有一个以上的表位或被抗体识别的位点，因此，暴露于抗原的动物的血清可以具有针对同一蛋白质的不同区域的多克隆抗体。
然后，免疫荧光利用动物产生针对特定抗原的多克隆抗体的能力，以纯化该抗体，随后在其他情况下将其用于检测相同抗原。
在大多数用于某些免疫荧光技术的荧光染料或分子中，有异硫氰酸荧光素（FITC），异硫氰酸四甲基罗丹明5和6（TRITC），许多花菁，例如Cy2，Cy3，Cy5和Cy7，以及称为AlexaFluor®的染料，例如AlexaFluor®448。
协议
免疫荧光方案取决于许多因素，但是一般而言，它包含线性的步骤序列，包括：
- 板和细胞的准备
- 固定样品
- 通透性
- 封锁
- 免疫染色或免疫染色
- 组装与观察
-制备
样本中
样品的制备将取决于样品的性质和要进行的经验类型。下面将解释最简单的情况，其中涉及悬浮细胞的使用。
悬浮液中的液体，即在液体培养基中的细胞，必须首先通过离心与之分离，然后必须用缓冲液或等渗的“缓冲液”洗涤，以保持其完整性。
通常，使用一种称为PBS的磷酸盐盐水缓冲液，将细胞重悬，然后再次离心该混合物，以获得不含可能含有干扰物质的培养基的细胞。
的刀片
还必须仔细准备用于显微镜观察的玻片，在此之后将固定细胞以进行相应的下游处理。
这些被聚赖氨酸溶液覆盖或“敏化”，聚赖氨酸是一种合成聚合物，由于其氨基和细胞的正电荷之间的静电相互作用，将在细胞和固体支持物之间充当“分子胶”。覆盖细胞的蛋白质上带有负电荷。
固定样品
该过程包括固定细胞内发现的蛋白质，以保持其空间位置完整。使用的分子必须能够穿过所有类型的细胞膜并与共价蛋白形成晶格。
甲醛和低聚甲醛，戊二醛甚至甲醇被广泛使用，将细胞样品孵育一定时间，然后用等渗缓冲液洗涤。
固定细胞后，它们将继续附着在先前用聚赖氨酸敏化的薄片上。
通透性
根据所进行测试的类型，有必要使研究中的细胞通透或不渗透。如果要知道细胞表面某种蛋白质的位置，存在或不存在，则无需进行透化。
另一方面，如果您想知道蛋白质在细胞内的位置，则通透性是必不可少的，包括将样品与Triton X-100（一种能够透化细胞膜的去污剂）一起孵育。
封锁
所有免疫学技术的基本步骤是阻断。在该过程的这一阶段，封闭包括在敏化的片上覆盖所有聚赖氨酸分子未附着细胞的位点。也就是说，它可以防止任何非特定的联合。
通常，在PBS缓冲液中使用牛血清白蛋白（BSA）溶液进行封闭，并且用该溶液孵育时间越长，获得的效果越好。在包括堵塞在内的每个步骤之后，有必要洗净剩余的溶液。
免疫染色或免疫染色
免疫染色或免疫染色程序将主要取决于它是直接还是间接免疫荧光（见下文）。
如果是初次免疫荧光或直接免疫荧光，则将样品与所需抗体一起孵育，该抗体必须与荧光染料偶联。孵育步骤包括在也包含BSA但比例较低的溶液中稀释抗体。
如果是二级或间接免疫荧光，则应进行两次连续孵育。首先使用所需抗体，然后使用能够检测一级免疫球蛋白恒定区的抗体。这些二抗与荧光团共价结合。
该技术用途广泛，在直接免疫荧光的情况下，只要存在与不同荧光团偶联的一抗，就可以同时标记每个样品一种以上的抗原。
为了在间接免疫荧光中同时进行标记，必须确保每种一抗在不同的动物体内产生，并且每个二抗都与不同的荧光团偶联。
像封闭一样，抗体孵育时间越长，效果越好。在每个步骤之后，必须洗去未与样品结合的过量抗体，并且在第二免疫荧光法中，必须在添加第二抗体之前封闭。
某些技术会使用与免疫染色无关的其他染色剂，例如用DAPI荧光团对核DNA进行染色。
组装与观察
在与荧光团的最后孵育时间内，有必要将样品保持在黑暗中。为了在显微镜下观察，通常使用一些物质来保持与抗体偶联的荧光团的荧光。
种类
直接和间接免疫荧光的图形摘要（来自Wikimedia Commons的Westhayl618）
直接或初级免疫荧光
它与通过使用荧光抗体检测抗原有关。使用此技术的主要优点是它的速度，但是，在此过程中可能会发生许多非特异性结合的情况，尤其是在研究人血清时，因为它们富含高度异源的抗体。
间接或二次免疫荧光
它也被称为“三明治”技术，这涉及到该技术的两步开发。第一个与非荧光抗体的使用及其与目标抗原的结合有关。
针对该第一抗体的恒定区（现在将用作抗原），使用能够识别它的第二抗体，该第二抗体与荧光分子相关。
荧光信号的出现将是第一种非荧光抗体与目标抗原之间特异性识别的结果。该第一抗体的存在决定了第二抗体的存在，该第二抗体被标记，并因此可以确定抗原的存在与否。
尽管比直接免疫荧光技术耗时得多（因为它包括一个更多的孵育步骤），但该技术并未涉及针对每种研究抗原的荧光抗体的设计，从经济角度来讲，更可行。
此外，就信号放大而言，它是一种更为灵敏的技术，因为一个以上的二级抗体可以与一级抗体的恒定区结合，从而放大了荧光信号的强度。
应用领域
如先前可能已经指出的，免疫荧光是一种极为通用的技术，在科学和临床领域中已被赋予了多种用途。它可以用来回答有关许多生物的生态，遗传和生理问题。
在临床应用中，它通过对研究患者的上皮组织进行直接或间接免疫荧光来直接诊断某些皮肤病。
免疫荧光技术已在单细胞生物（如酵母）中使用，以可视化核内和细胞质微管，肌动蛋白和相关蛋白，10nm细丝以及细胞质，膜和细胞壁的其他成分。
参考文献
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