的标准计数琼脂是固体时,在非选择性培养介质中,设计用于微生物存在于饮用水,废水,乳品饮料,其它食品中的样品需氧负荷的定量。这种培养基也被称为PCA琼脂,其英文缩写为English Plate Count Agar。它由Buchbinder,Baris和Goldstein于1953年创建。
标准计数琼脂培养基由酵母提取物,三肽,葡萄糖,琼脂和蒸馏水组成。该配方包含基本的营养成分,可以满足当前有氧微生物负荷的需求,而并非如此。
用于在标准琼脂计数中计算CFU的十进制稀释度。资料来源:Quentin Geissmann
由于培养基不含抑制剂,细菌可以不受任何限制地生长,因此非常适合一般菌落计数。但是,噬菌斑定量技术不能检测到所有存在的细菌,而只能检测能够在接种标准计数琼脂的环境条件下生长的细菌。
从这个意义上讲,平板定量技术通常试图确定需氧中温型细菌的数量,即在25至40°C的温度下生长,最佳生长温度为37°C的细菌的数量。 。
这个细菌群非常重要,因为在那里发现了大多数人类致病菌。
应当指出的是,有时量化食物中存在的嗜冷细菌的数量可能会很有趣。这些细菌是在低温(<20°C)下生长的细菌,即使在冷藏时,也会导致食物更快地分解。
同样,在某些类型的食品(例如罐头食品)中,在50°C至80°C或更高温度范围内发展的嗜热细菌可能很重要。
微生物定量以每克或毫升样品的菌落形成单位(CFU)表示。
基础
标准计数培养基旨在允许非耐性好氧细菌成功生长,因为酵母提取物,三肽和葡萄糖为微生物的良好生长提供了必要的营养。
另一方面,该介质具有浅色和透明外观,这就是为什么该介质非常适合可视化通过深层接种方法(板倾倒)形成的菌落。
还可以通过Drigalski铲表面播种方法进行菌落计数。
当微生物负荷高时,必须对研究样品进行十进制稀释,以便能够计算CFU。
应该注意的是,美国公共卫生协会(APHA)推荐使用这种培养基进行有氧嗜温菌计数。
制备
称重23.5 g脱水培养基,并溶于一升蒸馏水中。要完全溶解,应经常搅拌加热混合物直至沸腾。后续步骤取决于要使用的播种技术。
对于倾板技术
通过将12到15毫升分配到试管中进行分配。随后,在121℃的高压釜中灭菌15分钟。允许垂直固化为块状。存放在冰箱中直至使用。
使用时请熔化插头。融化后,在制备样品时将其放在44-47°C的水浴中。
用于表面播种
将培养基在121°C的高压灭菌器中灭菌,然后在无菌培养皿中分配20 ml。让其固化,倒置并保存在冰箱中直至使用。
使用前先调温板。培养基的pH值应为7.0±0.2。
用
在水和食物的微生物分析过程中,标准计数琼脂用于有氧嗜温计数技术。有氧嗜温菌的计数是必要的,因为它决定了所研究样品的卫生质量。
该技术的应用(使用这种介质)可以对孤立菌落进行宏观可视化以对其进行量化。
板倾倒技术(深度播种)
-处理
该技术包括以下内容:
1)均质化样品以重新分布存在的细菌。
2)最初的悬浮液应在90毫升稀释液(10 -1)中10克或10毫升样品的比例的无菌瓶或袋中制成。
3)从最初的悬浮液中,根据样品类型进行相应的十进制稀释。例如:(10 -2,10 -3,10 -4)。用蛋白ept水或磷酸盐缓冲液稀释。
为此,取1 ml初始悬浮液并将其置于9 ml稀释剂中,如有必要,继续稀释,现在取1 ml 10 -2稀释液,依此类推。
4)取每种稀释液1 ml,放在空的无菌培养皿中。
5)向每个平板中加入12至15 ml预先熔化并沉降在44-47°C的标准计数琼脂。
6)轻轻旋转平板,使样品沿琼脂均匀分布并使其固化。
7)颠倒平板,在需氧条件下于37°C孵育24至48小时。
8)最后,检查平板并以允许的稀释度对菌落计数。选择那些具有30至300 CFU的板作为计数。
计数可以手动完成,也可以使用菌落计数设备。
每毫升样品的允许值可能因国家/地区而异,具体取决于所依据的法规。
-UFC的计算
通用计算使用以下公式完成:
CFU定量的一般计算公式。资料来源:国家药品,食品和医疗技术管理局(ANMAT)。食品的微生物分析,官方分析方法,指示微生物。2014年第3卷。可用:anmat.gov.ar
用1或2位数字表示结果,并乘以适当的10。示例:如果结果为16,545,则将基于第三位四舍五入为17,000,并将其表示为:1.7 x 10 4。现在,如果结果为16,436,则将其四舍五入为16,000,并表示1.6 x 10 4。
表面播种技术
-处理
-Inocular用0.1ml的直接样本,如果它是液体,初始悬浮液10 -1或连续稀释液10的-2,10 -3等,在标准计数琼脂板的中心。
-用Drigalski刮刀或L形玻璃棒均匀分散样品,静置10分钟。
-将板倒置,并在37°C下需氧培养24至48小时。
-继续计数菌落,选择20-250 CFU之间的平板。
-UFC的计算
为了进行计算,应用了稀释系数,它是反比例的。该数字四舍五入为2位有效数字(根据第三位四舍五入),并以10为底的幂表示。例如,如果未稀释的样品中计数为224 CFU(10 -1),则报告为22 x 10 1 CFU ,但如果数字为225,则报告为23 x 10 1 CFU。
现在,如果在10 -3稀释液中算出199 CFU ,则将报告20 x 10 4 CFU,但是如果在相同稀释液中计数153 CFU,则将报告15 x 10 4 CFU。
质量检查
可以使用已知的认证菌株评估标准计数培养基,例如:大肠杆菌ATCC 8739,金黄色葡萄球菌ATCC 6538,枯草芽孢杆菌ATCC 6633,发酵乳杆菌ATCC 9338,表皮葡萄球菌ATCC 12228,弗氏志贺氏菌ATCC 12022。
如果培养基处于最佳条件,则在所有情况下都可以预期令人满意的生长,除了发酵乳杆菌可以有规律的产量。
为了评估培养基的无菌性,应将每批制备的一块或两块板(不接种)在37°C的需氧环境中孵育24小时。此时间过后,在培养基中应观察不到生长或颜色变化。
局限性
-不要将琼脂融化一次以上。
-准备好的培养基只要将其保存在冰箱中并避光,其寿命最长可达3个月。
-该培养基不适用于苛刻或厌氧的微生物。
参考文献
- 国家药品,食品和医疗技术管理局(ANMAT)。食品的微生物分析,官方分析方法,指示微生物。2014年第3卷。可用:anmat.gov.ar
- Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo,SA平板琼脂。2009年,可访问:http://f-soria.es
- 康达Pronadisa实验室。根据APHA和ISO 4833的标准方法琼脂(PCA)。可从以下网站获得:condalab.com
- 大不列颠实验室。琼脂平板计数。2015.可用在:britanialab.com
- Camacho A,Giles M,OrtegónA,Palau M,Serrano B和VelázquezO.2009。《食品微生物分析技术》。第二版。墨西哥国立自治大学化学学院。墨西哥。可用在:depa.fquim.unam